导读
Introduction
手性是众多功能性分子的核心特征之一。以药物分子为例，据统计，目前约半数上市药物为手性化合物，而同一药物分子的不同对映异构体在生物体内往往表现出差异显著的生物活性。因此，在药物研发过程中，通常需要分别获得并评估两种构型产物的性质。
刘臻课题组长期致力于酶催化脱氢反应的研究。在前期工作中，课题组成功挖掘并开发了一种黄素依赖酶（PtOYE）催化的氧化脱氢体系，实现了手性环己烯酮化合物的高效合成（Nature Synthesis, 2024）。手性烯酮广泛存在于药物和天然产物中，同时也是合成化学领域重要的合成砌块。相较于传统化学方法对过渡金属催化剂和强氧化剂的高度依赖，酶催化脱氢凭借绿色温和、反应选择性高等优势，展现出广阔的应用前景。
然而，该领域仍面临一个悬而未决的挑战：现有酶催化脱氢体系通常只能获得单一构型的产物，缺乏能够生成互补构型产物的脱氢酶。因而，开发具有立体互补性的酶催化脱氢新体系，不仅有望进一步拓展生物脱氢反应的应用范围，也将推动黄素依赖酶催化功能边界的拓展，并深化对其催化机制的理解。
近日， 来球网-来球网下载
/北京生命科学研究所刘臻实验室与西班牙赫罗纳大学Marc Garcia-Borràs团队合作，在《Angewandte Chemie International Edition》发表题为“Redirecting a Native Ene-Reductase toward Desaturation with Reverse Enantioselectivity” 的研究论文。
研究人员通过系统性的酶库筛选，发现了一种来源于恋臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的黄素依赖酶XenA，并证实其具备反手性脱氢活性，尽管该催化活性极其微弱。值得注意的是，XenA是一类经典的烯烃还原酶，其天然催化功能为烯烃还原反应，此前尚无关于其催化脱氢反应的报道。
随后，研究团队以XenA为工程改造起点，将定向进化与PROSS计算设计相结合，显著增强了其非天然脱氢活性，并进一步优化了反应的立体选择性。基于分子动力学模拟的计算分析，并结合机理实验研究，团队系统阐明了XenA催化脱氢反应的分子机制，揭示了该酶催化体系所遵循的独特反应过程。
立体互补选择性脱氢酶的挖掘
为寻找与已知脱氢酶具有不同立体选择性的酶催化剂，研究人员对OYE家族进化树中不同亚类的代表性黄素酶进行了系统筛选。筛选过程中，一个关键发现是：绝大多数测试酶均生成 (R)-构型产物，仅有来源于恋臭假单胞菌的XenA能够催化生成 (S)-构型环己烯酮产物（83% ee）。尽管其初始脱氢活性极低，产率仅约2%，但这一反向立体选择性使其成为理想的工程改造起点。
蛋白质改造：从定向进化到PROSS辅助稳定性优化
为将天然烯还原酶XenA改造为高效脱氢酶，研究团队结合定向进化与计算辅助设计，对其催化活性和稳定性进行了系统优化。研究初期，团队发现活性中心高度保守的酪氨酸位点Y183发生突变后，脱氢反应产率反而提升超过18倍，揭示这一脱氢酶催化体系与前期报道系统的显著差异性。随后，研究人员利用PROSS计算设计算法对蛋白序列进行全局热稳定性优化，获得了一个稳定性显著提高的蛋白骨架。该策略不仅使酶能够在更高温度下保持活性，也为后续有益突变的积累提供了更大的优化空间。
经过多轮迭代改造，研究团队最终获得了最优变体XenA_4，其携带46个突变位点，约占蛋白全长序列的12.7%。与野生型相比，XenA_4的熔解温度（Tm）提高约11℃，脱氢反应产率总体提升47倍，对映选择性则由83% ee进一步提高至96% ee。作者随后确认XenA_4可以有效地针对一系列底物进行催化脱氢反应。
机制研究：二聚体结构诱导的底物结合模式与非经典去质子化机制
1）反手性的形成机制：二聚体结构诱导底物翻转结合
研究团队进一步探究了XenA催化反向对映选择性脱氢反应的分子基础。通过SEC-MALS分析并结合结构模型研究，证实XenA及其变体以同源二聚体形式存在。相邻单体的C端α-螺旋嵌入对方活性口袋，形成空间受限的催化空腔。结合分子动力学模拟、关键残基突变和氘代同位素示踪实验，研究人员发现二聚体界面残基对底物芳环产生显著位阻作用，迫使底物以甲基朝向FMN辅因子的“翻转”构象结合，从而决定了其反向立体选择性。
2）非经典去质子化机制：残基网络协同水分子充当催化碱
除独特的立体控制模式外，XenA体系还展现出不同于经典脱氢酶的去质子化机制。传统脱氢酶通常依赖活性中心保守酪氨酸残基作为催化碱，而XenA变体则不再依赖这一机制。H/D交换实验显示，无论是XenA变体还是重新引入酪氨酸的XenA_3-F183Y，对底物羰基α位两侧氢的交换均未表现出明显偏好；相比之下，经典脱氢酶PtOYE则表现出约10:1的交换偏好。上述结果表明，XenA体系已摆脱对传统酪氨酸催化碱的依赖，转而采用由残基网络与水分子协同参与的非经典去质子化机制。
本工作中实验部分由刘臻实验室的研究生曾清清完成，计算研究由西班牙赫罗纳大学Marc Garcia-Borràs团队的Cristina Berga与Carla Calvó-Tusell博士完成。刘臻研究员与Marc Garcia-Borràs研究员为本文共同通讯作者。本研究得到科技部（BT与IT融合重点专项2023YFF1204400）、北京市昌平区“U35培苗计划”（CHPU35202501004）、化学生物协同物质创制全国重点实验室开放课题基金（sklscbs202506）、来球网-来球网下载
以及北京生命科学研究所等机构的支持。
论文链接
//doi.org/10.1002/anie.3155545
